菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的研究
摘要：為研究固態(tài)發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件，本試驗(yàn)以木聚糖含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，依次研究單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、菌種比例、單酶發(fā)酵、雙酶發(fā)酵、雙酶比例、酶的用量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響。
結(jié)果表明：發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1:9,發(fā)酵時(shí)添加纖維素酶量為1000U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達(dá)1.421mg/g，與對(duì)照組相比顯著提高了257%。
木聚糖是以β-(1，4)-D-吡喃型木糖構(gòu)成主鏈，以4-0-甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖(陳國(guó)榮等，2009)。木聚糖經(jīng)酶解可用于制備低聚木糖，機(jī)體攝入低聚木糖可顯著促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)。提取木聚糖主要有以下幾種方法:酸水解法(徐曉燕等，2007)、堿液提取法(石波，2001)、蒸汽爆破法（張帆，2013)、蒸煮提取法(趙建等，2004)、預(yù)處理-酶水解法(楊瑞金等，2007)等。玉米芯是制備木聚糖的理想原材料之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年有2000萬(wàn)噸以上的玉米芯副產(chǎn)物，可以為木聚糖的制備提供豐富的原料資源(孫軍濤等，2015)。近年來(lái)，微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)被應(yīng)用于制備木聚糖，本試驗(yàn)以發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究單菌發(fā)酵、雙菌發(fā)酵、菌種比例、單酶發(fā)酵、雙酶發(fā)酵、雙酶比例、酶用量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響，為玉米芯的綜合利用及木聚糖的制備提供理論依據(jù)。
材料與方法
1 材料
1.1 菌種
枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌均購(gòu)買于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
1.2 原料
玉米芯、豆粕、麩皮均購(gòu)于市場(chǎng)，粉碎過(guò)篩。纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶均購(gòu)買于濟(jì)南諾能生物工程有限公司。
1.3 培養(yǎng)基
營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，MRS肉湯培養(yǎng)基，麥芽汁培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東某生物科技有限公司。固體發(fā)酵培養(yǎng)基：80%玉米芯，10%豆粕，10%麩皮。
1.4 儀器
JJ-CJ-1F超凈工作臺(tái)、TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)、SYQ-DSX-28OB手提式壓力蒸汽滅菌器、CP224C電子天平、GX2智力光照培養(yǎng)箱、Epoch2酶標(biāo)儀等。
2 方法
2.1 菌種的活化及種子液的制備
枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿中劃線，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落于滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床37℃，120r/min培養(yǎng)24h，即為種子液。
植物乳桿菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的MRS肉湯瓊脂平皿中劃線，36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落于滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床36 ℃，120r/min培養(yǎng)24h，即為種子液。
酵母菌:將冷凍保存的菌種在滅菌的麥芽汁瓊脂平皿中劃線，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落于滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中，置于搖床28℃，120 r/min培養(yǎng)24h，即為種子液。
2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
本試驗(yàn)玉米芯固態(tài)發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時(shí)間72h，裝料量50g，料水比1：1，接種量10%，初始pH為自然pH。以木聚糖含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)依次確定出最佳的發(fā)酵菌種比例和商品酶種類及用量。
2.3 木聚糖提取液的制備
固態(tài)發(fā)酵后，將發(fā)酵產(chǎn)物與無(wú)菌蒸餾水以1：10的比例裝人三角瓶中，置于37 ℃的恒溫水浴搖床以135r/min振蕩1h，然后5000r/min，4℃離心10min，提取上清液待測(cè)。
2.4 檢測(cè)指標(biāo)
還原糖測(cè)定方法:3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)。
式中:m為還原糖的質(zhì)量;M為待測(cè)產(chǎn)物的質(zhì)量(丁勝華等，2010)。
3 數(shù)據(jù)分析
所有試驗(yàn)均重復(fù)三次，試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SASS 9.2軟件，采用單因子方差分析(ANO-VA)并用Duncan’s方法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并繪圖。
結(jié)果與分析
1 單菌發(fā)酵玉米芯對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響
枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌分別發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖1，對(duì)照組為不加菌發(fā)酵。
由圖1可知，四株菌都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米芯的產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為0.764mg/g，與對(duì)照組相比提高了282%(P<0.05)，故確定單菌最佳發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌。
2 雙菌發(fā)酵玉米芯對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響
枯草芽孢桿菌分別與地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、酵母菌組合發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖2，對(duì)照組為不加菌發(fā)酵。
由圖2可知，三種菌種組合都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中枯草芽孢桿菌和酵母菌組合發(fā)酵玉米芯的產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為0.991mg/g，與對(duì)照組相比提高了395%(P<0.05)，故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的組合為發(fā)酵玉米芯的最佳菌種組合。
3 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對(duì)玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響
枯草芽孢桿菌與酵母菌以不同比例發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量見圖3，對(duì)照組為不加菌發(fā)酵。
由圖3可知，枯草芽孢桿菌與酵母菌以任何比例接種都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中當(dāng)枯草芽孢桿菌與酵母菌的比例為1：9時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為1.108mg/g，與對(duì)照組相比提高了454%(P<0.05)，故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例為1：9。
4 單酶發(fā)酵玉米芯對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響
發(fā)酵玉米芯時(shí)，分別添加纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖4,對(duì)照組為不加酶發(fā)酵。
由圖4可知，發(fā)酵時(shí)添加這四種酶都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中添加纖維素酶的發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為1.319mg/g，與對(duì)照組相比提高了 231%(P<0.05)，故確定最佳發(fā)酵單酶為纖維素酶。
5 雙酶發(fā)酵玉米芯對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響
纖維素酶分別與木聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶組合發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖5,對(duì)照組為不加酶發(fā)酵。
6 纖維素酶與木聚糖酶的比例對(duì)玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響
纖維素酶與木聚糖酶以不同比例發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量見圖6， 對(duì)照組為不加酶發(fā)酵。
由圖6可知，纖維素酶與木聚糖酶以任何比例都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中當(dāng)纖維素酶與木聚糖酶的比例為1：0時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，為1.498mg/g，與對(duì)照組相比提高了276%(P<0.05)，故確定纖維素酶與木聚糖酶的比例為1：0,即纖維素酶為最佳發(fā)酵添加酶。
7 纖維素酶的添加量對(duì)玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量的影響
纖維素酶以不同添加量發(fā)酵玉米芯，發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖含量見圖7,對(duì)照組為不加酶發(fā)酵。
由圖7可知，纖維素酶以任何添加量都可以增加發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖的含量，其中當(dāng)纖維素酶添加量為1000U和4000U時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量最高，分別為1.421、1.446mg/g，與對(duì)照組相比分別提高了257%、263%，但差異不顯著(P>0.05)，考慮到成本，故選擇纖維素酶最適添加量為1000U/g飼料。
討論
玉米芯是木聚糖含量最高的農(nóng)副產(chǎn)品，含量為35%〜40%，是制備木聚糖的最佳原料。李里特(2004)、楊瑞金(2000)、邵佩蘭等(2000)利用不同的提取方法證明，從玉米芯中提取木聚糖是可行的，而且提取率較高，羅曉風(fēng)(2005)等用堿法提取木聚糖的得率為22.7%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1：9,發(fā)酵時(shí)添加纖維素酶量為1000U/g飼料的條件下，木聚糖含量可達(dá)1.421mgg，與對(duì)照組相比顯著提高了257%。
玉米芯中主要的多糖為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，半纖維素主要是由木聚糖組成，因此半纖維素含量的高低直接決定著木聚糖的得率。由于纖維素與半纖維素、木質(zhì)素等以多種物理或化學(xué)作用結(jié)合，形成致密的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，單純使用酶降解玉米芯會(huì)導(dǎo)致酶解效率不高，生產(chǎn)成本增大(何亮亮，2012)。因此，要保證在實(shí)際生產(chǎn)中纖維素酶有較高的酶解效率，必須消除木質(zhì)纖維在結(jié)構(gòu)上的酶解障礙，因而在對(duì)木質(zhì)纖維進(jìn)行酶解之前，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行預(yù)處理是必要的。常用方法之一是利用細(xì)菌、真菌等微生物的降解作用達(dá)到去除木質(zhì)素，使纖維組織松散的目的。Zhang等(2007)用白腐菌處理的竹子降解后的還原糖得率是未處理樣品的2.34倍，顯示出較好的處理效果。枯草芽孢桿菌與酵母菌是微生物發(fā)酵技術(shù)常用的發(fā)酵菌種，都具有產(chǎn)纖維素酶的能力（甄玉國(guó)，2005;Antonio等，2004)，本試驗(yàn)通過(guò)使用枯草芽孢桿菌、酵母菌與纖維素酶協(xié)同發(fā)酵玉米芯，可以降解玉米芯中部分半纖維素使其表面出現(xiàn)空隙，增加酶和纖維素的可接觸面積，從而提高酶解率及木聚糖產(chǎn)量(鄭志，2012)。本試驗(yàn)可為菌酶協(xié)同制備木聚糖的研究提供一些理論依據(jù)。
結(jié)論
在本試驗(yàn)條件下，發(fā)酵玉米芯制備木聚糖的最佳菌酶組合條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為1：9,發(fā)酵時(shí)添加纖維素酶量為1000U/g飼料。在此條件下，木聚糖含量可達(dá)1.421mg/g，與對(duì)照組相比顯著提高了257%。
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2020年已全面禁抗，我們之前經(jīng)常在飼料中添加的抗生素進(jìn)行促生長(zhǎng)行為將是違法，否則面臨巨額罰單。如何既能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)又能夠形成無(wú)抗養(yǎng)殖呢？其實(shí)中草藥在促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖健康和生長(zhǎng)、改善肉蛋奶品質(zhì)大有可為，特別是將中草藥發(fā)酵后效果提升4-28倍等好處，這個(gè)實(shí)施方案比你想象中效果更好，運(yùn)用的沒(méi)有不被效果折服的，值得嘗試驗(yàn)證
我們的技術(shù)僅需在出欄前半個(gè)月左右運(yùn)用益生菌+酶制劑+中草藥相關(guān)的無(wú)違禁安全產(chǎn)品，肉質(zhì)改善非常顯著，且可以批量化生產(chǎn)。
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