生物方法降解黃曲霉毒素的研究
導讀
黃曲霉毒素(aflatoxin簡稱AFT或AT)主要由基因同源的黃曲霉和寄生曲霉等真菌在一定的環境條件下發生的復雜酶促反應生物合成的次級代謝產物。目前鑒定出的共有18種，分為B族和G族兩大類，在動物體內代謝可產生黃曲霉毒素M1、M2等多種同源衍生物。它給糧食及飼料造成嚴重污染，其中黃曲霉毒素B1是黃曲霉毒素中毒性最強的物質。黃曲霉毒素主要作用于肝臟，引起肝臟病變。食用了含黃曲霉毒素的食物，可引起人畜急性中毒從而引發疾病，且黃曲霉毒素有強致癌、導致基因突變和畸形作用，嚴重威脅動物及人類健康，如何除去糧食及飼料中的黃曲霉毒素被人們廣泛關注。
1黃曲霉毒素常規脫毒方法
1.1 物理化學方法脫毒
黃曲霉毒素常規脫毒方法有物理方法和化學方法。物理學方法包括霉變部分篩選剔除法、射線輻射降解法、高溫加熱處理法、溶劑萃取法，這些方法對除去黃曲霉毒素有一定效果。在實際操作中，篩選剔除法過程繁瑣，射線輻射法對不同樣品的處理效果存在很大差異，高溫加熱會破壞飼料中的營養成分，同時射線輻射和高溫處理將會產生大量能源消耗，有機溶劑萃取產生的廢物無法很好的處理。從而這些方法都很難在大規模批量生產中應用。
化學處理方法是用化學試劑破壞黃曲霉毒素的化學結構，其中內酯環存在于黃曲霉毒素的一般結構式中，只有內酯環被打開時，熒光才會消失，毒性才會消除。化學處理方法包括氨化、堿化和臭氧等處理方法，其中氨化和堿化處理是通過化學作用使黃曲霉毒素內酯環破壞，生成相應的香豆素銨鹽或者鈉鹽，從而消除黃曲霉毒素的毒性；臭氧的氧化功能打開黃曲霉毒素內酯環，消除黃曲霉毒素的毒害。但這些方法雖然對去除黃曲霉毒素有一定效果，但在脫毒時，會產生有毒有害化學成分殘留，破壞飼料產品品質，且臭氧處理成本高，不易操作，此方法同樣很難應用在規模化生產中。
1.2 吸附方法脫毒
在工業生產中，一種是以添加蒙脫石、沸石、膨潤土等硅酸鹽吸附劑以及納米吸附劑的物理吸附來去除霉菌毒素，其吸附原理是硅酸鹽吸附劑強大的表面積與靜電作用，與帶有離子極性的霉菌毒素結合。其中硅酸鹽吸附劑對黃曲霉毒素有很好的吸附能力，劉媛婷等通過體外實驗表明水合鋁硅酸鹽對黃曲霉毒素的吸附率可達到99%，且吸附劑能夠明顯減輕黃曲霉毒素對動物的毒害作用。史瑩華等通過豬日糧中添加蒙脫石吸附劑，顯著降低了黃曲霉毒素對動物肝臟的毒害作用。但硅酸鹽吸附方法在吸附毒素的同時會吸附氨基酸、維生素等營養成分，使飼料中的營養成分含量降低，其中存在著動物體內代謝過程重新被暴露的風險。此方法有待于進一步優化，明確吸附劑在動物體內的代謝過程，減少吸附劑對營養物質的吸附。
另一種吸附方法是利用微生物對黃曲霉毒素吸附，研究較多的是酵母菌和乳酸菌的吸附作用，常見的有釀酒酵母、鼠李糖乳酸桿菌、干酪乳桿菌等。酵母菌的細胞壁電鏡下為“三明治”結構口 ，其細胞壁的特殊結構和成分形成的分子作用力吸附黃曲霉毒素，Hernandezmendoza等利用緩沖液重復洗滌來評價釀酒酵母一黃曲霉毒素復合物的穩定性，實驗結果表明釀酒酵母能穩定的與黃曲霉毒素結合，防止黃曲霉毒素被胃腸道吸收；Shah等發現黃曲霉毒素B1與乳酸茵形成黃曲霉毒素B1-乳酸菌復合物來吸附黃曲霉毒素。Redzwan等通過建立體外動物模型和人類臨床試驗，表明益生菌添加劑可以減少黃曲霉毒素在人類膳食和動物飼料中的暴露，降低和緩解黃曲霉毒素在人體和動物體內的毒害作用，最終被應用于飼料工業。但微生物的吸附作用為物理吸附，是一個可逆的過程，毒素不能完全被吸附，也存在著在動物體內毒素被釋放的風險，單一的微生物吸附對黃曲霉毒素的解毒作用存在一定的局限性。
2生物學方法降解黃曲霉毒素
生物學方法降解黃曲霉毒素，是近年來研究熱門的一種脫毒方法，主要為微生物的降解，包括真菌和細菌兩大類。在黃曲霉毒素生物方法降解的研究中，大量的利用篩選得到能夠降解黃曲霉毒素的生物菌種，通過自身代謝產生某種胞內酶或者胞外酶將黃曲霉毒素分子的毒性基團降解為無毒害的物質被生物利用或通過代謝排出體外。另一方面通過生物酶的單一活性成分對黃曲霉毒素進行降解為無毒的其他組分，但生物酶的來源、活性以及穩定性需要優化與提高。
2.1 真菌對黃曲霉毒素的降解作用
降解黃曲霉毒素的真菌，包括寄生曲霉菌、根霉菌、白腐真菌、假密環菌和黑曲霉等 引。國外對真菌的研究較早，Doyle等通過發酵發現寄生曲霉在生長14 h后，菌絲產生一種乳過氧化物酶將黃曲霉毒素B1降解，其產物為黃曲霉毒素B2a的衍生物和另一種水溶性衍生物，降解產物的毒性遠低于黃曲霉毒素B1。Cole等通過同位素標記法研究表明根霉菌能夠將黃曲霉毒素降解為兩個具有熒光的羥基化合物。Motomura等從一種平菇中分離出降解黃曲霉毒素的酶，通過熒光含量的測定，表明這種酶能夠降解黃曲霉毒素的內酯環，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得到其蛋白分子量大小大概為90 ku。
國內對黃曲霉毒素的真菌降解研究中，李冰等研究黑曲霉發酵對黃曲霉毒素B1的降解效果，在一定件條下黃曲霉毒素B1的降解率達到93.28%，在對其胞外粗提液、活細胞、細胞提取物降黃曲霉毒素進行分析時，發現其中黑曲霉的胞外粗提液對黃曲霉毒素的降解率最高，表明黃曲霉毒素B1的降解可能是黑曲霉分泌的一種酶的化學作用。徐丹等通過研究黑曲霉對黃曲霉生長、產毒以及對黃曲霉毒素的影響，驗證了黑曲霉既能抑制黃曲霉生長、產毒，又能夠降解黃曲霉毒素。
劉大嶺等發現食用型真菌假密環菌能夠降解黃曲霉毒素，其活性物質為一種胞內的氧化酶，提取的粗酶液能夠高效降解黃曲霉毒素，降解效率達到80%；隨后從提取物中分離出能降解黃曲霉毒素毒性的解毒酶，通過SDS-PAGE測定活性蛋白大小表觀分子量為51.8 ku；進一步構建互補脫氧核糖核酸(cDNA)文庫并建立原核克隆及表達載體，得到重組黃曲霉毒素解毒酶活性蛋白(ADTZ)，基因大小為2 088 bp，編碼695個氨基酸，并成功的將黃曲霉毒素解毒酶基因在畢赤酵母中表達；對黃曲霉毒素解毒酶三維結構外層部位的關鍵氨基酸殘基進行了改造，獲得了一種對胰蛋白酶抗性提高的重組黃曲霉毒素氧化酶(AFO)，其基因片段大小為2 321 bp，對胰蛋白酶的抗性比黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)提高2.73倍，半衰期延長了72min，其他酶學性質與野生型酶基本一致。
以上研究表明，真菌微生物降解黃曲霉毒素的機理是一個復雜過程，易受環境和自身因素影響，可控性、穩定性差，降解產物不明確，但真菌中的單一活性成分對黃曲霉毒素有很好的降解效果。目前國內外對黃曲霉的研究更多的是黃曲霉毒素產生和降解機理的研究。
2.2 細菌對黃曲霉毒素的降解作用
國內外對細菌生物降解黃曲霉毒素有大量的報道，研究表明許多細菌微生物具有一定的降解黃曲霉毒素的能力。國外的研究中，Lilleho等1966年通過篩選酵母菌、霉菌、細菌、放線菌、藻類和真菌孢子降解黃曲霉毒素的能力，最終篩選出橙色黃桿菌能夠降解黃曲霉毒素B1，Doyle等證明這種物質為一種乳過氧化物酶。Smiley等進一步報道橙色黃桿菌的粗蛋白質提取物在水溶液中降解黃曲霉毒素B1的降解率能夠達到74.5%；分別用熱處理、脫氧核糖核酸酶I處理、蛋白酶K處理初蛋白質提取物，降解率分別為5.5 %、80.5% 、34.5%，進一步驗證這種對黃曲霉毒素的降解機理可能是酶促反應。Cserhati等篩選出32株紅球菌菌株能夠降解黃曲霉毒素，利用發酵培養、酶聯免疫吸附法(EUSA)檢測，結果有16株菌株對黃曲霉毒素的降解效率達到100%，4株菌株的降解效率達到98%。
國內對黃曲霉毒素的細菌降解研究中，李俊霞等利用香豆素，從動物糞便、發霉糧食、實驗室原有菌株等1 500種微生物細菌和芽孢桿菌樣品中篩選出能夠降解黃曲霉毒素的菌株，并用黃曲霉毒素B1作為培養基底物進行復篩，共得到來自腸道的8株菌株和來自發霉飼料的2株菌株能夠降解黃曲霉毒素，其中從貘糞便中獲得的假單胞菌屬嗜麥芽窄食單胞菌對黃曲霉毒素的降解效果最好。關舒等對嗜麥芽窄食單胞菌培養基胞外粗提液、活細胞和細胞提取物分別進行降解黃曲霉毒素處理，37℃下孵育72 h后檢測胞外提取物中黃曲霉毒素B1減少了82.5%，而活細胞提取物對黃曲霉毒素的降解效率非常低，用蛋白酶K，蛋白酶K加十二烷基硫酸鈉(SDS)和加熱處理培養物上清液能顯著降低或根除培養物上清液的降解活性。證明其中的嗜麥芽窄食單胞菌對黃曲霉毒素的降解為生物酶的降解。
雷元培等對枯草芽孢桿菌進行降解黃曲霉毒素解毒的生物活性、抗菌性及抗逆性的研究。實驗結果表明，發酵后的上清液中存在解毒活性組分，對解毒活性物質進行加熱和蛋白酶K變性處理后，解毒活性顯著降低，表明起解毒作用的活性物質是其分泌的一種胞外酶，同時所分泌的活性蛋白具有強解毒活性，特異性和作用效果溫和的特點，不會破壞飼料中的營養成分，適用于除去飼料中的黃曲霉毒素。
3前景展望
目前，生物防治黃曲霉毒素研究取得了一定的進展，但國內外使用生物學方法降解黃曲霉毒素在飼料工業中的應用剛剛起步。黃曲霉毒素雖能被不同的菌株所降解，但目前的防治方法依然還存在著許多問題，一般研究主要側重于降解黃曲霉毒素菌株的篩選，但對于降解的機理及解毒酶特性需要進一步研究。黃曲霉毒素分解酶相關的基因報道還比較少，且酶的產量和活性不太高，毒素不能被完全降解。因此，需要用到生物化學、分子生物學、基因工程的手段對微生物菌種進行篩選及改造，并獲得黃曲霉毒素分解酶的組成基因并進行高效表達，開發出能夠高效降解黃曲霉毒素的生物菌種。將生物發酵技術應用于飼料工業，以減少飼料的污染和浪費，降低養殖行業和飼料行業經濟成本。
注：本文由生物飼料開發國家工程研究中心（BFC）小編整理發布，如有任何建議或意見及投稿等，請您加小編微信（13260429991）交流互動。
參考文獻略
- 上一篇：廣西助農公司在博白縣正在對每個鄉鎮建立達標生態養殖示范點，手把手教會養殖場達標 [2017-07-07]
- 下一篇：河池市南丹縣大力發展特色生態養殖 [2017-07-07]
