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發酵飼料菌種配比篩選與發酵工藝優化

2021-06-02 15:28:22      點擊:3200

摘要:試驗通過選擇枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母菌和保加利亞乳桿菌作為混合發酵劑發酵全價飼料,可以進一步提高飼料利用率。在確定三種菌最佳混合比例的基礎上,對飼料發酵參數進行進一步優化,探討鐵腳麻雞發酵飼料的最佳工藝,為提高養殖效益提供理論依據。

枯草芽孢桿菌是耗氧菌,發酵過程消耗大量的養分,維持厭氧的環境,促進厭氧菌乳酸菌生長,同時也抑制有害耗氧菌的生長;乳酸菌主要是產酸,對飼料質量起到關鍵性作用;酵母菌是兼性厭氧菌,生長環境較寬,能產酸和大量的菌體蛋白。三種菌種的功效各不相同,采用三種菌種的最佳的混合配比,能夠讓其發酵的飼料營養更平衡、更利于吸收。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌、乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌;YPD、LB、MRS培養基、超凈工作臺、搖床培養箱、發酵菌種、配合飼料等試驗器材。

1.1.1 固體培養基

1)YPD固體每300mL水中蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖、葡萄糖:6g、3g、6g、6g、6g單獨滅菌,然后加入300mL無菌蒸餾水中在121℃滅菌。

2)LB固體每300mL水中蛋白胨、酵母粉、氯化鈉:3g、1.5g、3g,在121℃滅菌鍋中滅菌。

3)MRS固體體培養基18.9g/300mL在121℃進行滅菌。

4)生理鹽水ac10.9%;Nacl:7.2g+800mL蒸餾水。

1.1.2 液體培養基

1)YPD液體。稱酵母浸膏1g加入80mL蒸餾水中溶解,葡萄糖2g加入20mL蒸餾水中溶解,分別滅菌溫度為121℃,后混合。

2)LB液體。酵母浸膏0.5g、蛋白胨1g、Nacl 1g,加無菌蒸餾水至100mL。

3)MBS液體。成品:5.224g/100mL加無菌蒸餾水,封口121℃無菌鍋滅菌。

1.2 試驗方法

滅菌:將配制YPD、LB、MRS培養基(固液),3個10mL離心管、100μL、1mL規格槍頭、無菌生理鹽水等進行滅菌;

分裝:打開無菌超凈工作臺,三個10mL離心管做好標記,分別加入YPD、LB、MRS液體培養基8mL;

接種:將酵母菌80μg、枯草芽孢桿菌80μL、乳酸桿菌80μL分別加入到含有對應培養基的離心管中,并密封好;

培養:將酵母菌在28℃、15h、搖床培養、有氧,枯草芽孢桿菌:35℃、20h、搖床培養、有氧,乳酸桿菌:37℃、15h、靜置培養、無氧。

1.3 觀察與計數

培養時間到后,取出進行染色鑒定、計數。酵母菌用美蘭染色法,枯草芽孢桿菌及乳酸桿菌用革蘭氏染色法,染色結束后進行鏡鑒。

2 結果與分析

2.1 菌種最佳配比濃度的篩選

2.1.1 平板菌落計數結果

本研究所使用的酵母菌在有氧條件下28℃搖床培養15h后進行菌落計數,枯草芽孢桿菌在有氧條件下35℃搖床培養20h后進行菌落計數,乳酸桿菌37℃靜置培養15h后進行菌落計數,原菌液的含菌量結果如表1所示。

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2.1.2 菌種活化與濃度梯度配制

將三種菌的含菌量分別設三個水平(見表2),按L₉(3⁴)的正交表進行設計。最后將不同配比的三種菌按1%的接種量接種到飼料中,在常溫下進行為期7天的發酵。飼料水分含量為45%。具體接種方法為:將底料與菌種混勻后裝入500mL罐頭瓶中進行發酵,每個罐頭瓶裝發酵料200g,發酵完成后對發酵飼料的質地、顏色、氣味等進行感官評定及菌落計數。

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結合發酵飼料感官評定和活菌數測定結果,初步得出發酵用菌種配比為:酵母菌1.8×108cfu/mL、乳酸菌1.35×108cfu/mL、枯草芽孢桿菌4×1011cfu/mL。

2.2 混菌一次發酵參數的優化結果

2.2.1 發酵工藝設置與優化

本試驗先活化三種菌,分別獲取乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌,將三種活化菌分別制配成最佳菌種配比為酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL,在最佳菌種配比的條件下,以發酵溫度、發酵時間、飼料水分、微生物接種量4個因素為考察因子,每個因素設3個水平,按L₉(3⁴)正交試驗表進行試驗設計,共9種組合,每種組合做3次重復,最后以活菌數做為評判指標。

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2.2.2 活菌數的測定

稱取0.6g發酵飼料至裝有5.4mL無菌生理鹽水的10mL離心管中,在振蕩器上充分震蕩30min,用滅菌吸管吸取10ml至滅菌空試管中,在漩渦混合器上震蕩 3min,然后吸取1mL加入到9ml無菌生理鹽水中,在漩渦混合器上混合1min,進行10倍系列釋,選取3個適當的稀釋倍數,傾注平板,每個梯度做兩個平行,恒溫培養、計數,算出發酵飼料中的活菌數。發酵結束后,仔細觀察,可見發酵第五天飼料質地松軟、顏色為黃色,香味淡香為最佳。通過對發酵飼料的質地、顏色、氣味等進行感官評定及菌落計數,并進行常規養分的檢測,得出來水分含量為45%時,發酵的飼料比較好;溫度在25℃-30℃的時候發酵較好,此時產生的活菌數和活性物質含量達到最優。

3 結論

綜上所述,最佳菌種配比為酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌1.8×108、1.35×108、4×1011cfu/mL;鐵腳麻雞育肥期飼料發酵最佳工藝為發酵溫度為25-30℃,發酵時間為5天,飼料含水量為45%。

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